Esterilización y Tinciones

Prosiguiendo con los objetivos del blog, se presenta la esterilización requerida para los medios de cultivo así como el instrumental que se usara para el aislamiento de la bacteria es a través de calor húmedo, ya que se utilizará material de vidrio por lo que se puede proceder con temperaturas de 121°C y 1.05 atm de presión 15 minutes bajo estas condiciones en la autoclave.

Para los métodos de siembra y aislamiento se debe hacer en condiciones de esterilidad.

Una vez que se tengan las UFC por los medios de cultivo y las tecnicas de aislamiento se deberia realizar la tinción diferencial de Gram, por lo que la bactaria debe resultar Gram Negativa y despues comprobar que la bacteria no tiene formas esporuladas mediante la tinción slectiva "Schaeffer y Fulton, endosporas". Con este se podra dar paso a la realización de las pruebas bioquimicas para diferenciar a la bacteria.

Redactaremos a continuación el modo de realizar las tinciones, así como los reactivos a utilizar.

-> Tinción diferencial de Gram

Previo a la tinción deberás preparar dos frotis por cada dilución a utilizar del medio liquido.

1. Cubrir el frotis con dos gotas de cristal violeta durante 1 minuto.

2. Lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

3. Sacudir el exceso de agua y sin dejar secar, cubrir el frotis con dos gotas de lugol duarante 30 segundos

4. Lavar el frotis con agua destilada

5. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante (mezcla alcohol-cetona) dejando que escurra, aproximadamente 10 segundos o hasta observar el alcohol transparente.

6. Lavar con agua.

7. Aplicar dos gotas de safranina durante 1 minuto

8. Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar secar al aire.

9. Observar al microscopio.

-> Tinción selectiva: Schaeffer y Fulton, endosporas

Previo a la tinción deberás preparar dos frotis por cada dilución a utilizar del medio liquido.

1. Agregar verde de malaquita sobre el frotis de talo manera que cubra toda la preparación

2. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición durante 5 minutos

3. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición durante 5 minutos, evitando que se seque el colorante (si es necesario agregar un poco más).

4. Retirar del baño de agua el portaobjetos y dejar enfriar un poco.

5. Eliminar el colorante con agua destilada de una piseta.

6. Retirara el exceso de agua.

7. Cubrir con safranina duarante 30 segundos.

8. Lavar con agua destilada.

9. Dejar enfriar en seco.

10. Observar al microscopio

*Recordemos que nuestra bacteria es gram negativa y no tiene forma esporulada.

Y por el momento es todo lectores, como siempre dejaremos nuestra referencias

Manual de prácticas; Microbiologia Ambiental.