Identificación de la Psuedomona putida

Y como sabemos que hemos estado publicando mucha información he aquí un esquema que te ayudará asimilar de manera más fácil lo que te hemos dicho: 

Nos despedimos por el momento ... 

Las pruebas bioquímicas

Hola bloggeros, esta tarde les traemos información de las pruebas bioquímicas que se utilizaran para identificar la Pseudomona putida, para esto debemos retroceder un poco en el tiempo y tratar de recordar cuales son las especificaciones de la bacteria tal como que es aerobia estricta, mesofilo, con cierta movilidad y que pertenece al guro de las pseudomonas fluorescentes... por lo tanto las pruebas bioquímicas que te ayudaran a identificar a la bacteria son las siguientes:

*Prueba oxidasa (positiva)

-Fundamento: los discos contienen oxalato de dimetil-para-fenilendiamina, el cual es el sustrato de la enzima oxidasa. los MOs que producen la enzima oxidasa se evidencian por que en presencia de oxígeno atmosférico y citocromo c, se oxida el sustrato presente en los discos a un compuesto de color rojo fucsia.

-Siembra: 

>En tubo: a partir de un cultivo puro, hacer una suspensión densa en 0.2 mL de agua de destilada estéril, y agregar un disco de OX. 

>En portaobjetos: humedeces el disco OX con una fota de agua y luego colocar sobre el la colonia en estudio (esta metodologia se utiliza cuando se tiene escaso número disponible de colonias en estudio). 

- Incubación: generalmente dentro del minuto, y a temperatura ambiente se detectan los resultados positivos, una reacción lenta pasados los 2 minutos debe considerarse negativa 

-Resultados: se debe tomar como positivo el cambio de color a fucsia y como negativo el que no cambie de color. 

Algunas de las limitaciones son que la prueba debe usarse con cultivos frescos (18-24 hrs) y que no provengan de medios con azucares.

*Prueba catalasa (positiva)

-Fundamento: la catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. el desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva. 

-Método: En un portaobjetos se coloca una gota de peróxido de hidrógeno al 30% con ayuda de una pipeta pasteur después se suspende la bacteria. Reacciona casi al instante y se considera negativa aquella reacción lenta sin formación de burbujas. 

*Fermentación de glucosa (medio O/F) (negativa)

-Fundamento: Se basa en la determinación del metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono. Las bacterias oxidativas producen ácido solo en el tubo abierto expuesto al oxigeno atmosférico; los microorganismos fermentadores producen ácidos en ambos tubos; las bacterias no sacaroliticas son inertes en este medio y permanecen con un pH alcalino. 

-Procedimiento:

Se debe preparar el medio básico de Hugh Leifson, cullo indicador es el azul de bomotimol, que vira de color dependiendo del pH del medio. 

Son necesarios dos tubos del medio para la prueba. El medio de un tubo se expone al aire y el otro se cubre con aceite mineral o parafina líquido.

-Resultados: 

O / F

Amarillo/amarillo: fermentativo 

facultativo

Amarillo/verde: oxidativo

Verde/amarillo: fermentador extricto

Azul/azul: no fermentador (usa 

peptonas)

*Y una de las representativas es la prueba King B (positiva)

-Fundamento: en el medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos, la concentración de fosfatos estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de piocianina y piorrubina.

-Siembra: a partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio.

-Incubación: durante 18-24 horas a 35-37 °C, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30°C, o dejar a 22°C y observar diariamente hasta 7 días.

Nota: algunas cepas de P. putida solo producen fluoresceína a temperatura ambiente, y se pueden obtener resultados falsos negativos si el medio se incuba a 30-35°C, por eso, ante la ausencia de crecimiento luego de incubación a 35-37°C,se recomienda dejar los tubos dejar los tubos conteniendo el medio a temperatura ambiente.

-Resultados: Examinar las colonias bajo luz ultravioleta a 260nm. Se considera un resultado positivo la observación de fluoresceína, que es un pigmento de color amarillo, amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por el medio de cultivo debido a fenómenos de difusión.

Bueno eso es todo por el momento bloggeros, y como siempre referencias

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b12/oxidasa.htm

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/pseudoagarf.htm

http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-v/pb-v-3-catalasa_oxidasa.htm

Esterilización y Tinciones

Prosiguiendo con los objetivos del blog, se presenta la esterilización requerida para los medios de cultivo así como el instrumental que se usara para el aislamiento de la bacteria es a través de calor húmedo, ya que se utilizará material de vidrio por lo que se puede proceder con temperaturas de 121°C y 1.05 atm de presión 15 minutes bajo estas condiciones en la autoclave.

Para los métodos de siembra y aislamiento se debe hacer en condiciones de esterilidad.

Una vez que se tengan las UFC por los medios de cultivo y las tecnicas de aislamiento se deberia realizar la tinción diferencial de Gram, por lo que la bactaria debe resultar Gram Negativa y despues comprobar que la bacteria no tiene formas esporuladas mediante la tinción slectiva "Schaeffer y Fulton, endosporas". Con este se podra dar paso a la realización de las pruebas bioquimicas para diferenciar a la bacteria.

Redactaremos a continuación el modo de realizar las tinciones, así como los reactivos a utilizar.

-> Tinción diferencial de Gram

Previo a la tinción deberás preparar dos frotis por cada dilución a utilizar del medio liquido.

1. Cubrir el frotis con dos gotas de cristal violeta durante 1 minuto.

2. Lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

3. Sacudir el exceso de agua y sin dejar secar, cubrir el frotis con dos gotas de lugol duarante 30 segundos

4. Lavar el frotis con agua destilada

5. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante (mezcla alcohol-cetona) dejando que escurra, aproximadamente 10 segundos o hasta observar el alcohol transparente.

6. Lavar con agua.

7. Aplicar dos gotas de safranina durante 1 minuto

8. Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar secar al aire.

9. Observar al microscopio.

-> Tinción selectiva: Schaeffer y Fulton, endosporas

Previo a la tinción deberás preparar dos frotis por cada dilución a utilizar del medio liquido.

1. Agregar verde de malaquita sobre el frotis de talo manera que cubra toda la preparación

2. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición durante 5 minutos

3. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición durante 5 minutos, evitando que se seque el colorante (si es necesario agregar un poco más).

4. Retirar del baño de agua el portaobjetos y dejar enfriar un poco.

5. Eliminar el colorante con agua destilada de una piseta.

6. Retirara el exceso de agua.

7. Cubrir con safranina duarante 30 segundos.

8. Lavar con agua destilada.

9. Dejar enfriar en seco.

10. Observar al microscopio

*Recordemos que nuestra bacteria es gram negativa y no tiene forma esporulada.

Y por el momento es todo lectores, como siempre dejaremos nuestra referencias

Manual de prácticas; Microbiologia Ambiental.

Medios de cultivo, técnicas de aislamiento y siembra

Que tal bloggeros, como siempre actualizando este espacio con la finalidad de dar a conocer un poco más acerca de la tan menciona Pseudomona putida, en esta ocasión les traemos información sobre los medios de cultivo a los que la bacteria responde satisfactoriamente al producir las colonias especificas y con ello se adquiere el aislamiento de la misma al sembrarlas de manera determinada.

Para empezar los medios de cultivo

ü  Medios de cultivo a utilizar incluyendo la composición y el tipo de medio de acuerdo a la clasificación por NOM, así como el procedimiento para su preparación

Los medios de cultivo a utilizar durante el proceso de aislamiento de la Pseudomona putida se muestran a continuación. Se incluye una breve descripción de su preparación y clasificación acorde a la Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, QUE ESTABLECE LAS ESPECIFICACIONES SANITARIAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. GENERALIDADES.

Nombre: Medio OF con glucosa (oxidación fermentación de Hugh y Leifson)

Clasificación: Medio semisólido selectivo de enriquecimiento

Ingredientes                                         Cantidades

Peptona                                                   2 g

Extracto de levadura                                 0,5 g

Cloruro de sodio                                       20 g

Dextrosa                                                 10 g

Púrpura de bromocresol                            0,015 g

Agar                                                        3 g

Agua destilada                                         1 000 ml

Preparación del medio de cultivo: Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el agar. Ajuste el pH a 7,4 ± 0,2. Coloque en tubos y esterilice en autoclave 20 minutos a 121ºC.

Nombre: Medio basal

Clasificación: Medio sólido  selectivo

Ingredientes                                                                            Cantidades  

-Agua destilada                                                                           1 L 
-Fosfato de potasio monobásico  KH2PO4                                 0.4 g 
-Fosfato de potasio dibásico  K2HPO4                                       1.6 g 
-Cloruro de amonio  NH4Cl                                                        1.5 g 
-Cloruro de magnesio MgCl2 6H2O                                            0.17 g 
sextahidratado 
-Sulfato de sodio heptahidra tado  NaSO4 7H2O                        1.5 g 
-Cloruro de calcio dihidratado  CaCl2 2H2O                               0.045 g 
-Solución mineral*                                                                       1.0 ml

Preparación del medio de cultivo: Disolver los componentes en 0.5L de agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121°C y 1atm de presión por 20 minutos



*La solución mineral se agrega después de esterilizar

Nombre: Agar noble (Difco o similar)

Clasificación: Medio sólido selectivo

Preparación del medio de cultivo: Pesar 1,2 gr. de Agar Noble (Difco o similar) y disolver en 100 mL de SST 0,1 M, pH 7,4 adicionada de un conservador (10 mg de merthiolate).

Prosigamos con aislamiento ...

Una vez que se tenga la muestra de suelo procedente de los alrededores de plantas petroquímicas o industrias textiles, se pesaran 10 g de suelo. 



El método para el aislamiento y cuenta de las bacterias hidrocarbonoclastas del suelo es por la técnica de cuenta por dilución y vaciado en placa utilizando un medio mineral basal, este se debe disolver en agar noble para obtener un medio de cultivo solido y que así contenga petróleo crudo o un hidrocarburo específico de interés, como única fuente de carbono y energía. El petróleo ligero que se impregna en un papel filtro permite que las bacterias hidrocarbonoclastas se alimenten de los hidrocarburos volátiles, o la adición de un hidrocarburo en solución asperjando la superficie de la caja ya inoculada.


Existen ciertas limitaciones, que son las siguientes: 

El agar noble para preparar el medio de cultivo sólido debe ser un agar puro, libre de cualquier contaminante; de lo contrario puede haber crecimiento de bacterias por las impurezas que pueda contener, permitiendo el crecimiento de bacterias no hidrocarbonoclastas. Se recomienda inocular cajas de medio mineral sin hidrocarburo para tener un control negativo y asegurar la pureza del agar. 


El petróleo crudo o hidrocarburo utilizado para este método debe ser ligero (volátil), ya que el acceso de esta fuente de carbono y energía es a través de los vapores que se generan de ella. 

Protocolo de diluciones y técnicas de siembra. 


1) En condiciones estériles, adicionar 1 g del suelo a una botella de dilución o matraz con tapa de rosca con 99 ml de solución salina isotónica estéril (dilución 10^-2). Dispersar el suelo y homogeneizar con agitación vigorosa.
2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solución salina estéril (dilución 10^-3). De ahí se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales hasta 10^-10 o las adecuadas, asegurándose de
utilizar una punta o pipeta estéril diferente en cada paso. Agitar de forma constante con vórtex en cada paso.
3) Tomar 0.1 ml de la dilución seleccionada y colocarla en el centro de la superficie del medio de cultivo seleccionado para el crecimiento. Realizar esto por triplicado y con tres diluciones próximas (Ej. 10^-3, 10^-4 y 10^-5) para asegurar la cuenta.
4) Extender la alícuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio previamente esterilizada (inmersa en alcohol y pasándola por la flama del mechero permitiendo su enfriamiento). Asegurar una distribución homogénea por toda la superficie del medio.
5) Incubar las placas de forma invertida a 30ºC en ausencia de luz.
6) Después de un periodo de incubación, contar el número de colonias y reportar como unidades formadoras de colonias (UFC)/ g de suelo seco.


Procedimiento


Se debe preparar previamente a todo el procedimiento una solución mineral en el orden que indica la siguiente tabla

Una vez que se tenga la solución se puede proseguir con el siguiente procedimiento

1) Preparar el medio de cultivo con los componentes del medio basal disolviéndolos en el orden señalado por su composición en un litro de agua destilada.
2) Ajustar el pH a 7.0, después adicionar 15 g de agar puro (agar noble).
3) Esterilizar a 1.05 atm, 121°C y durante 15 min. Dejar enfriar, cuando el medio se encuentre a 50°C aproximadamente, añadir la solución mineral estéril previamente preparada (1 ml por L de medio)
4) Vaciar el medio en cajas de Petri en condiciones estériles, esperar a que gelifique.
5) En un disco de papel filtro estéril impregnar el petróleo crudo ligero estéril y colocarlo en la parte interna de la tapa de la caja de Petri. El hidrocarburo que se volatiliza servirá como fuente de carbono y energía.
6) Preparar la muestra de suelo y diluciones e inocular cada caja como se indica en la sección de protocolo de diluciones y tecnicas de siembra.
7) Después de cinco días de incubación, proceder al conteo de colonias. Las colonias que se deberán contar son las que hayan formado un anillo y un sedimento de color verde azulado.
8) Para el cálculo final de unidades formadoras de colonias (UFC) se debe considerar la dilución con que se inoculó la caja, la cantidad de inóculo (0.1 ml) y la humedad de la muestra.


Cálculos

1) Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias.
2) Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g s.s. UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH).

Donde:
UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco.
NC = número de colonias en una caja.
FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó
la muestra con la que se inocula la caja (10^-2 a 10^-10).
V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.
P = peso de la muestra húmeda = 1 g.
FH = factor de corrección de humedad (1-(%humedad/100))

Y eso es todo por hoy, como siempre nuestras referencias ... esta vez fueron muchas por el hecho de consultar los requerimientos de los medios con base a las NOM

http://www.espatentes.com/pdf/2085239_a1.pdf

http://www.vgdusa.com/Noble-Agar.htm

http://www.cbm.uam.es/jlsanz/docencia/archivos/practicas.pdf

http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/092ssa14.html

http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/031ssa13.html

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/guia.pdf

http://www.bvs.ins.gob.pe/insprint/salud_publica/nor_tec/22.pdf

Aislamiento : http://www2.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf

¡Estamos de vuelta!

¡La espera no fue tan larga! Y hemos vuelto con la segunda parte de nuestro blog...

De ahora en adelante hablaremos del aislamiento de este microorganismo.

Como se mencionó anteriormente, es una bacteria presente en el suelo. Nosotros consideraremos aislarlo en lugares con clima árido o semiárido. La bacteria puede encontrarse en la zona de la rizósfera y podría ser aislada del sistema radicular de las gramíneas que esten cerca de industrias. 

Es necesario tomar una muestra de suelo para empezar el aislamiento.

Nos despedimos sin más por el momento. Y como ya saben aquí están nuestras referencias

REFERENCIAS:

http://redalyc.uaemex.mx/pdf/573/57322211.pdf

Importancia ambiental

¡Hola otra vez!

En esta ocasión, haremos un pequeño resumen de lo dicho en entradas anteriores con la finalidad de rescatar la importancia ambiental de nuestro microorganimo...

La importancia ambiental de la bacteria Pseudomona putida radica esencialmente en que permite la biorremediación de suelos y acuíferos debido a la degradación que realiza sobre los hidrocarburos.

Otro aspecto a considerar dentro de la importancia de este microorganismo para el área ambiental lo muestran estudios relizados en Venecia donde la bacteria ha sido monitoreada y evaluada en su etapa de desarrollo terminal, en la cual esta se auto destruye y forma biopolímeros degradables.

Y ahora...unos anuncios:

1. Aquí terminamos con los aspectos generales de nuestro MO por lo tanto...
2. Es hora de un break durante el cual buscaremos más información

Así que no sufran pues volveremos pronto con más información para ustedes. De momento les dejamos un link que nos pareció muy interesante sobre uno de los usos que se le está dando a este microorganismo (aunque debemos avisar que está en inglés) El artículo trata  sobre la degradación de pinturas ´por parte de este microorganismo, esperamos sea de su agrado

http://we-make-money-not-art.com/archives/2007/06/marta-de-meneze.php

Nos despedimos por ahora...¡Hasta pronto!

Nutrición de la P. putida

¡Que tal bloggeros! en esta ocasión tenemos para ustedes información sobre la nutrición de la P. putida

Como se mencionó con anerioridad la Pseudomona putida degrada distintos hidrocarburos entre los que se encuentran el benceno, tolueno, hexadecano y alquilobenceno de cadenas laterales. Dado que la nutrición de los microorganismos depende de la fuente de carbono, la fuente de energía y la fuente de electrons podemos decribir a la P. putida de la siguiente manera:

• Por su fuente de carbono: Heterótrofa. Como ya se mencionó degrada algunos hidrocarburos, pero es incapaz de degradar la glucosa
• Por su fuente de energía: Quimiotrofa. Posee dioxigenasas necesarias para degradar los hidrocarburos a partir de reacciones de óxido-reducción.
• Por su fuente de electrones: Litótrofa. Como se mencionó en entradas anteriores la Pseudomona putida es una bacteria aerobia estricta, es decir que posee una molécula inorgánica (oxígeno) como dador de electrones.

Por tanto... la nutrición de la Pseudomona putida es del tipo Quimiolitoheterótrofa

¡Hasta pronto!

REFERENCIAS

http://bibliodigital.itcr.ac.cr:8080/dspace/bitstream/2238/206/1/pr%C3%A1ctica.pdf

http://genome.jgi-psf.org/psepu/psepu.home.html